期刊介绍
期刊导读
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利用技术和转录组筛选芍药属远缘杂交不亲和基
0 引言
【研究意义】牡丹(Paeonia suffruticosa)是芍药科芍药属的落叶亚灌木,迄今已有1 600多年的栽培历史,是我国的传统名花,也是我国特有的名贵观赏兼药用植物[1]。芍药科芍药属的牡丹与芍药,被誉为“花王和花相”,具有很高的观赏和生产价值。牡丹、芍药的新品种培育工作一直是科研和生产的重要内容。杂交育种作为传统的育种方式,也是牡丹、芍药的主要育种方法。利用杂交育种能够培育出一些具有较高观赏价值、抗寒、抗病等特点的新品种,而芍药属远缘杂交在国内的研究还处于初步阶段[2-3]。通过一系列研究发现受精前障碍是牡丹、芍药远缘杂交育种过程中存在的严重问题。在杂交过程中,虽然少量花粉能在柱头上萌发并穿过柱头,但花粉管的伸长却受到阻碍,并且在柱头上产生了大量的胼胝质,从而阻碍花粉管进入子房完成受精[4-5]。通过研究牡丹、芍药远缘杂交不亲和性的机制,对克服远缘杂交受精前障碍,实现牡丹、芍药远缘杂交具有重要意义。【前人研究进展】利用转录组和蛋白质组学筛选相关基因能够提高育种效率,克服常规育种中的困难[6-9]。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术是2004年美国应用生物系统公司(ABI)推出的一种新的蛋白质组学技术。其可靠的结果已经广泛应用在生命科学的多个领域,包括寻找功能蛋白,筛选生物标志物或特殊蛋白,研究抗逆机理等[10]。程云清等[11]以平欧杂交榛‘达维’的正常发育与败育子房为材料,进行蛋白样品技术分析,初步筛选获得可能参与调控榛子子房败育的候选蛋白37个。目前,有关iTRAQ技术应用于植物杂交不亲和性的研究鲜少报道。Chalivendra等[12]采用iTRAQ技术研究番茄的种间生殖障碍,通过对蛋白质组变化的分析发现花粉-柱头互作中的蛋白包括S-RNases、HT-A蛋白、细胞壁疏松以及抗性响应相关蛋白。LI等[13]使用iTRAQ技术揭示了大米花粉-柱头互作的蛋白机制,发现泛素化在授粉的信号转导过程中具有重要作用。利用转录组技术可以挖掘重要的功能基因,揭示优良性状的分子机制,还可以研究不同器官、不同环境胁迫下基因表达的差异。转录组测序技术已被广泛应用于蜡梅、油松、油桐等的研究中[14-16]。ZHOU等[17]对羊草成熟花柱、子房、叶片高通量测序,发现多达1 025个转录本在花柱中特异性表达,这些转录本集中在细胞间交流与信号传导。【本研究切入点】目前,中外学者探讨了一些植物育种中的不亲和机理,但关于牡丹、芍药远缘杂交不亲和机理的研究还很欠缺。本研究在前期芍药属远缘杂交的基础上,发现芍药自交与芍药属远缘杂交亲和性存在显著差异。【拟解决的关键问题】以芍药‘粉玉奴’自交、芍药‘粉玉奴’与牡丹‘凤丹白’杂交授粉后24 h的柱头为供试材料,分别进行转录组和iTRAQ分析及后续分析,以期从中筛选出与杂交不亲和性相关的基因及蛋白,揭示芍药属远缘杂交不亲和性分子机制,为芍药远缘杂交育种提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料及处理
供试母本芍药品种‘粉玉奴’与父本牡丹品种‘凤丹白’均引自山东菏泽,于2011年栽植于河南农业大学苗圃基地,植株生长良好,可以正常开花结实。于2018年4月初采取‘凤丹白’花粉,进行生活力测定后,储存于4℃冰箱。4月中下旬进行杂交,自交组合为‘粉玉奴’ב粉玉奴’,杂交组合为‘粉玉奴’ב凤丹白’。依据前期荧光显微观察确定杂交障碍发生的关键时间,授粉后24 h取自交与杂交的柱头用液氮速冻并置于-80℃冰箱内储存备用。
1.2 iTRAQ标记
采用丙酮沉淀法提取自交与杂交组柱头的蛋白质。对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理,用考马斯亮兰法测定蛋白浓度,经SDS-PAGE检测后将样品取等量蛋白Trypsin酶解,用iTRAQ 113、114标记未经授粉的柱头中的蛋白,iTRAQ 115、116标记杂交授粉后柱头中的蛋白,TRAQ 117、118标记自交授粉后柱头中的蛋白,最后将标记好的样品分别等量混合,应用强阳离子交换色谱(strong cation ex- change chromatography,cx)方法对混合后的肽段进行预分离,随后再进行液相分离和质谱分析。
1.3 转录组分析
采用天根生物公司多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)提取RNA,进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,120 V电泳20 min。取1 μL RNA样品,采用Thermo公司生产的Nano Drop ND-5000型紫外可见分光光度计测定样品的A260/A230和A260/A280的比值及RNA浓度,进行RNA的浓度和质量检测。检测符合建库要求的RNA送至武汉华大进行文库构建,采用BGISEQ-500平台进行高通量测序。
文章来源:《牡丹》 网址: http://www.mdzzs.cn/qikandaodu/2021/0223/1398.html